Молоко и молочные продукты. Определение активности щелочной фосфатазы. Часть 1. Флуориметрический метод для молока и молочных продуктов
Стандарт устанавливает флуориметрический метод для определения активности щелочной фосфатазы (ALP) в пастеризованном цельном, полужирном и обезжиренном молоке. Метод применим для молока коров, овец, коз и для молочных напитков. Метод также пригоден для определения высокой активности щелочной фосфатазы в сыром и термообработанном молоке с активностью более 2000 мЕ/л после заданного разбавления образца.
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ И МЕТРОЛОГИИ
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ российской ФЕДЕРАЦИИ
ГОСТ Р 52996- 2008
МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ
Определение активности щелочной фосфатазы
Флуориметрический метод для молока и молочныхпродуктов
ISO 11816-1:2006 Milk and milk products -Determination of alkaline phosphatase activity - Part 1: Fluorimetric method formilk and milk-based drinks (MOD)
Москва Стандартинформ 2009
Предисловие
Цели и принципы стандартизации вРоссийской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническомрегулировании», а правила применения национальных стандартов РоссийскойФедерации - ГОСТ Р1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения»
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН ОАО «Всероссийскийнаучно-исследовательский институт сертификации» (ОАО «ВНИИС») на основеаутентичного перевода международного стандарта, указанного в пункте 4
2 ВНЕСЕН Техническимкомитетом стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции набезопасность»
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕНВ ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию иметрологии от 6 ноября 2008 г. № 289-ст
4 Настоящий стандартявляется модифицированным по отношению к международному стандарту 11816-1:2006«Молоко и молочные продукты. Определение активности щелочной фосфатазы. Часть 1. Флуориметрический метод для молока и молочных продуктов » (ISO 11816-1:2006 «Milk and milk products -Determination of alkaline phosphatase activity - Part 1: Fluorimetric methodfor milk and milk-based drinks»).
При этом дополнительные слова,фразы, абзацы, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальнойэкономики Российской Федерации и особенностей российской национальнойстандартизации, выделены курсивом
5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандартупубликуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальныестандарты», а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемыхинформационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра(замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будетопубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальныестандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются такжев информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федеральногоагентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТРОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ
Определение активности щелочной фосфатазы
Часть 1
Флуориметрический метод для молока и молочных продуктов
Milk and milk products. Determination of alkaline phosphatase activity. Part 1. Fluorimetric method for milk and milk products
Дата введения -2010-01-01
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает флуориметрический метод дляопределения активности щелочной фосфатазы ( ALP ) в пастеризованном цельном, полужирном и обезжиренноммолоке. Метод применим для молока коров, овец, коз и для молочных напитков.
Метод также пригоден дляопределения высокой активности щелочной фосфатазы в сыром и термообработанноммолоке с активностью более 2000 мЕ/л после заданного разбавления образца.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы ссылки наследующие стандарты:
ГОСТР ИСО 5725-1 - 2002 Точность(правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1.Основные положения и определения
ГОСТР ИСО 5725-2 - 2002 Точность(правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2.Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного методаизмерений
ГОСТ26809 - 86 Молоко и молочные продукты.Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действиессылочных стандартов в информационной системе общего пользования - наофициальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию иметрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационномууказателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационнымуказателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен),то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим(измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, тоположение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающейэту ссылку.
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины ссоответствующими определениями:
3.1 активностьщелочной фосфатазы ( ALP активность): Активностьщелочной фосфатазы, присутствующей в продукте, определенная методом,установленным настоящим стандартом.
Примечание - Активность щелочной фосфатазы выражена в миллиединицах активностифермента на литр, мЕ/л.
3.2 единицаактивности щелочной фосфатазы: Объем фермента щелочной фосфатазы, который катализируетпревращение 1 мкмоль субстрата в минуту.
4 Сущность метода
Активность щелочной фосфатазы дляобразца измеряется путем непрерывного флуориметрического прямого кинетическогоанализа. В субстрате нефлуоресцентного ароматического монофосфорного эфира,2'-[2-бензотиазолил]-6'-гидроксибензотиазол фосфат, в присутствии любойщелочной фосфатазы, образованной из этого образца, происходит гидролиз егофосфатного радикала, производя продукт с интенсивной флуоресценцией.Флуориметрическое измерение активности щелочной фосфатазы проводят притемпературе 38 °С в течение трех минут, используя субстрат. Сюда включенапреинкубация субстрата и образца с последующим многократным кинетическимсчитыванием скорости реакции.
Примечание - Хотяиспытание длится 3 мин, первая минута является равновесным периодом дляобеспечения температуры образца 38 °С. Измерения активности фактическиначинаются со второй минуты и продолжаются до конца третьей минуты (т.е. 2мин).
5 Реактивы
Используются только реактивы признаннойаналитической чистоты, если нет других указаний, и дистиллированная илидеминерализованная вода или вода аналогичной чистоты.
5.1 СубстратФлуорофоса® в пробирках, каждая из которых содержит 144 мг порошка Флуорофоса®.
Этот субстрат нефлуоресцентногоароматического монофосфорного эфира,2'-[2-бензотиазо-лил]-6'-гидроксибензотиазол фосфат (Флуорофос®). СубстратФлуорофоса® остается стабильным в течение двух лет, если его хранить в закрытыхпробирках при температуре от 2 °С до 8 °С.
5.2 Буферный растворсубстрата, буферный раствор диэтаноламина ( DEA ), с ( DEA ) = 2,4 моль/дм 3 ,с рН 10,0 в пробирках вместимостью240 см 3 каждая.
Буферный раствор субстратаостается стабильным в течение двух лет, если его хранить в закрытых пробиркахпри температуре от 2 °С до 8 °С.
5.3 Рабочий субстрат
Оставляют субстрат Флуорофоса® ибуферный раствор субстрата до достижения комнатной температуры. Добавляютсодержимое одной пробирки с буферным раствором субстрата (240 см 3 )к содержимому одной пробирки Флуорофоса® (144 мг) (см. 5.1) и хорошоперемешивают, переворачивая, в течение 3 мин. Используют желтое стекло длязащиты против света.
Перед использованием полученныйраствор выдерживают при комнатной температуре как минимум 30 мин.
Используют аналого-цифровой тест,описанный в 9.4.1.1, для проверки устойчивости готового к использованиюсубстрата.
Рабочий субстрат остаетсястабильным в течение 60 дней, если он защищен от света и хранится притемпературе от 2 °С до 8 °С, или в течение 8 ч, если хранится при 38 °С. Неследует использовать рабочий субстрат, если получено показание выше 1200.
Примечание - Полученный объем рабочего субстрата (240 мл) является достаточнымприблизительно для 115 тестов.
5.4 Рабочиекалибровочные растворы, Флуорожелтый® ( FY ), 2'-[2-бензотиазолил]-6'-гидрокси-бензотиазол вбуферном растворе DEA .
Рабочие калибровочные растворыостаются стабильными в течение 18 мес, когда их хранят при температуре от 2 °Сдо 8 °С.
5.4.1Калибровочный раствор А, содержащий 0 мкмоль/дм 3 Флуорожелтого®.
5.4.2 Калибровочный растворВ, содержащий 17,24 · 10 -3 мкмоль/дм 3 Флуорожелтого®.
5.5 Раствор дляежедневного контроля прибора, содержащий 34,48 · 10 -3 мкмоль/дм 3 Флуорожелтого®.
6 Аппаратура
6.1 Фильтрованныйфлуориметр с термостатически регулируемым держателем кюветы при поддержаниитемпературы (38 ± 1) °С и правоугольной оптической системой, допускающейвозбуждение при длине волны 440 нм и испускание при 520-560 нм (например,прибор Флуорофос®).
Измерения должны бытьоптимизированы согласно инструкциям изготовителей.
6.2 Кюветы сменные,из нефлуоресцентного стекла, диаметром 12 мм и длиной 75 мм.
6.3.1 Дозаторфиксированного объема, дозирующий по 2,0 см 3 .
6.3.2 Пипеткавытеснительного типа или нагнетательная вместимостью 0,075 см 3 .
6.3.3 Пипеткавместимостью 2 см 3 .
6.4 Инкубаторныйблок, поддерживающий температуру (38 ± 1) °С, подходящий для помещения в нихкювет.
6.5 Парафильм 1 )или другая подходящая пленка лабораторного класса.
6.7 Водяная баня,поддерживающая температуру (63 ± 1) °С и (95 ± 1) °С.
6.8 Мерные колбы содной меткой вместимостью 100 см 3 .
1) Парафильм является примером подходящего продукта,выпускаемого в промышленности.
7 Отбор проб
В лабораторию должна быть отправленапредставительная проба. Ее следует оберегать от повреждений во времятранспортирования или хранения.
рекомендуется Отбор пробпроводить по ГОСТ26809 и [1].
8 Подготовка к испытанию
8.1 Молоко, несодержащее щелочной фосфатазы
Приготовляют молоко без фосфатазыдля испытания, тщательно дозируя требуемую порцию молока в пробирку илиподходящий контейнер, следя, чтобы оно не касалось краев или стенок контейнера.
Помещают пробирку или контейнер собразцом молока в водяную баню, установленную на 95 °С, нагревают до 95 °С ипродолжают его подогрев в течение 5 мин при этой температуре. Температуруконтролируют термометром или термисторным зондом, помещенным в центр пробиркиили контейнера. Затем образец быстро охлаждают.
Таким образом обработанный образецмолока тестируют, чтобы удостовериться, что активность щелочной фосфатазыменьше 10 мЕ/л.
8.2 Приготовлениеобразца для испытаний
8.2.1 Общие вопросы
Перед использованием всеиспытуемые образцы тщательно перемешивают, не нагревая.
8.2.2Пастеризованные испытуемые образцы
Пастеризованные испытуемыеобразцы используют в состоянии после поставки в требуемых количествах.
8.2.3Разбавление испытуемых образцов с высокими значениями ALP
Приготовляют разбавленные образцымолока, используя молоко без фосфатазы, для того чтобы их уровни активностищелочной фосфатазы ALP соответствовали аналитическому диапазону испытания(< 2000 мЕ/л). Разбавленные растворы хорошо перемешивают.
9 Проведение испытаний
9.1 Проверка рабочих характеристикприбора
Важно, чтобы до проведенияиспытания образцов была проведена проверка рабочих характеристик прибора наотклонение, рассеянное световое излучение и стабильность. Все параметрыфильтрованного флуориметра должны соответствовать требованиям 6.1.
Контрольные тесты качествавключают:
- ежедневный тест A / D (аналого-цифровоепреобразование), выполняемый для проверки правильности функционированияоборудования путем измерения точности канала A / D преобразования имониторинга A / D канала наотклонение по времени или температуре;
- ежедневныйконтрольный тест прибора с использованием ежедневного контрольного раствора вприборе для мониторинга любого электронного или оптического отклоненияфлуориметра.
Использование контрольных провероксистемы и реактивов, описанных в 9.4,настоятельно рекомендуется для ежедневного мониторинга параметров точностиприбора.
Калибровочные кривые обычностабильны. Прибор следует калибровать каждые три месяца. Однако в случае, когдафлуориметр устанавливают впервые или если процедуры обслуживания влияют насохраненную калибровку, или если проверенные контрольные значения показываютнеприемлемые результаты, то его калибруют повторно.
Если обнаружены измененияв калибровочной кривой, прибор также калибруют повторно, используя новый наборкалибровочных растворов А, В и С (см. 5.4).Калибровочную кривую устанавливают для каждого типа испытуемого продукта.
Перед использованиемкалибровочные растворы А, В и С смешивают, плавно переворачивая. С помощьюпипетки переносят по 2,0 см 3 калибровочных растворов А, В и Ссоответственно, каждого в двух экземплярах, в шесть предварительномаркированных кювет. Помещают кюветы в инкубаторный блок, установленный на 38°С, и предварительно нагревают в течение 10 мин.
С помощью нагнетательной или вытеснительнойпипетки добавляют 0,075 см 3 молока, не содержащего щелочнойфосфатазы, в шесть кювет. Закрывают кюветы парафильмом (см. 6.5).Перемешивают их содержимое с помощью вихревой мешалки в течение 5 с или путеммягкого переворачивания кювет. Возвращают кюветы в инкубационный блок.Выполняют калибровку в течение 10 мин после добавления испытуемого образца вкалибровочный раствор.
Начиная с калибровочного раствораА, выполняют следующие установившиеся процедуры калибровки. Перед помещениемкювет в фильтровальный Флуорофос® нажимают « CALIB » и выбирают меню « ALP Diary » (щелочная фосфатаза в молочных продуктах). Прокручивают меню и, когдаотображается продукт, который должен калиброваться, нажимают « ENTER ». Начиная с калибровочного раствора А помещаютэтот раствор во флуориметр и нажимают « START ». Когда измерение закончено, измеряют второйкалибровочный раствор А.
Такую же процедуру выполняют длякалибровочных растворов В и С, пока все процедуры не будут закончены. ПриборФлуорофос® автоматически вычисляет значение флуоресценции, полученное скалибровочными растворами В и С в сравнении с калибровочным раствором А, чтобыустановить калибровочный коэффициент прибора.
Когда калибровка выполнена,приступают к анализу испытуемых образцов.
9.3Определение
С помощью дозатора фиксированногообъема переносят 2,0 см 3 субстрата в маркированную кювету. Помещаюткювету в инкубаторный блок, установленный на 38 °С, и нагревают в течение 15мин.
С помощью пипетки добавляют 0,075см 3 хорошо перемешанного испытуемого образца (см. 8.2.2 или 8.2.3)к субстрату. Накрывают кювету парафильмом (см. 6.5).Сразу же перемешивают ее содержимое, используя вихревую мешалку (см. 6.6) в течение 5 с или плавнопереворачивая кювету. Вытирают кювету снаружи мягкой тканью и помещают ее вфильтровальный флуориметр.
Нажимают клавишу « TEST », появляется надпись « ALP Diary », затем нажимают « ENTER ». Прокручивают меню и нажимают « ENTER », когда отображается продукт, который долженанализироваться. Затем нажимают клавишу « START », чтобы начать испытание. На дисплее будет идтиобратный отсчет 60 с, пока субстрат и образец нагреется до 38 ° С. Через 60 с флуориметр начинает измерение,показывая флуоресценцию образца в единицах флуоресценции ( FLU ). Отображение начинается с 200 FLU и медленновозрастает в течение следующих двух минут. В конце третьей минуты периода приборФлуорофос автоматически выполняет необходимые вычисления и отображаетидентификационный номер образца, активность ALP вмиллиединицах на литр и среднее увеличение флуоресценции, если это былопредварительно задано. Затем эта информация будет напечатана.
Делят разность между двумяпоказаниями флуоресценции на время интервала (записанное в минутах), чтобыполучить среднее увеличение флуоресценции в минуту ( F /мин). Используют значение F /мин, чтобы вычислить активность ALP дляиспытуемого образца.
Прибор может отобразить надисплее и распечатать сообщение « Error : Unstable Reading , Repeat Test » (Ошибка.Нестабильное показание. Повторить испытание). В случае очень высокихрезультатов нужно разбавить испытуемый образец термообработанном молоком, несодержащим фосфатазы, и провести другое испытание.
Для очень низких результатов(обычно 6 FLU /мин), когданестабильные показания получаются чаще, оставляют кювету с образцом в камереФлуорофос® и проводят другое определение. Тогда обычно получаетсядействительный результат. Однако, если снова возникает ошибка из-занестабильных показаний, повторяют все определение с новым испытуемым образцом.
9.4Контрольные тесты
9.4.1 Контрольные проверкисистемы и реагентов
При использовании прибораФлуорофос тест A / D проводятежедневно перед испытанием.
Отмеряют 2,0 см 3 ежедневногоконтрольного раствора для прибора в маркированную кювету. Помещают кювету винкубаторный блок, установленный на 38 °С, на 10 мин.
Получают доступ к тесту A / D через меню « SETUP ». Нажимают клавишу « SETUP », затем выбирают пункт меню «A/D Test», нажимая <or>. При пустом держателе кюветы нажимают « START ». Ждут, когда цифры, появляющиеся на экранедисплея, стабилизируются.
Показание дисплея должно быть 302± 4. Если показание вне этого диапазона, очищают фильтры возбуждения ииспускания и повторяют тест A / D .
Вставляют предварительно нагретуюкювету в держатель кюветы. Закрывают крышкой. Когда показание дисплеястабильно, записывают отображаемое значение, которое должно быть 602 ± 12. Еслизначение вне этого диапазона, используют маленькую отвертку из поставки имедленно поворачивают винт потенциометра с левой стороны прибора по часовойстрелке или против, как необходимо, пока показание дисплея не будет 602.
Тест А/ D можно такжеиспользовать для проверки пригодности готового к использованию рабочегосубстрата. Только что приготовленный субстрат в режиме A / D обычно дает показаниеоколо 650 FLU , которое увеличивается со временем.
Не следует использовать рабочийсубстрат, когда на дисплее получено показание выше 1200 FLU .
9.4.1.2 Позитивный, негативный и PhosphaCheck - N ™ (контроль фосфатазы) механизмы контроля
После калибровки канала,используемого для коровьего молока, анализируют три контрольных раствора (т.е.позитивный, негативный и PhosphaCheck - N ™) путем добавления75 мм 3 каждого контрольного раствора к 2 см 3 предварительнонагретого субстрата. Выполняют тест ALP .
Показание для негативногоконтроля должно быть < 10, а для PhosphaCheck - N ™ < 40.
9.4.2 Испытуемый образеци механизмы контроля, связанные с прибором
9.4.2.1 Тестнегативного контроля
Включают тест негативногоконтроля с каждой партией испытуемых образцов. Нагревают испытуемый образец,как описано в 8.1. Показание приборадолжно быть меньше 10 мЕ/л, то есть флуоресцентная активность не детектируется.Если значение превышает 10 мЕ/л, повторяют действие 9.4.1.2.
9.4.2.2 Тестпозитивного контроля
Включают один или большемеханизмов позитивного контроля с каждой партией испытуемых образцов.Приготовляют образцы аналогичного или почти аналогичного состава, используяобразцы сырого молока, разбавленные молоком без фосфатазы.
9.4.3 Тест наинтерферирующие вещества
Если значения ALP получены вышеожидаемых, добавляют в кювету с помощью пипетки 0,075 см 3 испытуемогообразца и 2,0 см 3 калибровочного раствора А, которыйпредварительно нагревали в инкубаторном блоке, установленном на 39 °С, втечение 10 мин, и перемешивают.
Помещают кювету с этой смесью вприбор Флуорофос® и испытывают, как в 9.2. Если полученное значение превышает 20мЕ/л, значит, присутствует интерферирующее вещество. В этом случае повторяютиспытание со свежим образцом.
9.4.4 Контрольныйтест на теплостойкую щелочную фосфатазу
Добавляют другой испытуемыйобразец в пробирку. Вставляют термометр или термисторный зонд в пробирку и всепомещают в водяную баню, установленную на 63 °С. Когда испытуемый образецнагревают до 63 °С, его выдерживают при этой температуре 30 мин, затем быстроохлаждают. Определяют остаточную активность фосфатазы согласно 9.3. Любая остаточная активность обусловленаприсутствием теплостойкой микробной щелочной фосфатазы.
10 Вычисление и выражение результатов
10.1 Калибровочный коэффициент
Результаты вычисляютавтоматически прибором Флуорофос® посредством алгоритма, встроенного вфильтровальный флуориметр. Если результаты будут вычисляться вручную, действуютследующим образом.
Записывают значения флуоресценциикалибровочных растворов В и калибровочного раствора С (см. 5.4.3),сравнивают с калибровочным раствором А (см. 5.4.1),установленным на нулевую флуоресценцию на фильтровальном флуориметре.
Калибровочныйкоэффициент K вычисляют по формуле
где Fc - значение флуоресценции, полученное путем измерения калибровочногораствора С в сравнении с калибровочным раствором А, установленным на нулевуюфлуоресценцию (см. 9.2);
FB - числовое значениефлуоресценции, полученное путем измерения калибровочного раствора В в сравнениис калибровочным раствором А, установленным на нулевую флуоресценцию (см. 9.2).
10.2 Вычисление ALP
Активность щелочнойфосфатазы Ар, мЕ/л, вычисляют по формуле
где Fav - среднее значение флуоресценции, производимой в минуту (см. 9.3), измеренное в сравнении скалибровочным раствором А (см. 9.2)от начала второй минуты до конца третьей;
сВ - концентрация Флуорожелтого® в калибровочномрастворе В, в микромолях на 2 см 3 калибровочного раствора;
K - калибровочный коэффициент по (1), см 3 ;
V - объем испытуемого образца;
f - коэффициент разбавления (1 · 10 6 ) для пастеризованных образцов; дляиспытуемых образцов сырого молока f равно 1 · 10 8 ; для испытуемых образцов термообработанного молокаумножают f = 1 · 10 6 на коэффициент разбавления ft испытуемого образца ( f = ft · 10 6 ).
10.3 Выражение результатовиспытания
Результаты испытания выражают с точностью доближайшего целого знака миллиединицы.
11 Прецизионность
Прецизионность метода ирезультатов измерений рассчитывают по ГОСТР ИСО 5725-1 и ГОСТР ИСО 5725-2 .
11.1 Межлабораторное испытание
Детали межлабораторного испытанияприведены в приложении А. Значения, полученные изэтого испытания, можно применять для других диапазонов и матриц.
11.2 Повторяемость
Абсолютная разность между двумянезависимыми результатами единичных испытаний, полученными одним и тем жеметодом на идентичном испытуемом материале в одной и той же лаборатории одним итем же оператором, использующим одно и то же оборудование, в течение короткогоинтервала времени, должна не более чем в 5 % случаев превышать значения для г,приведенные в таблице 1.